SOP生物指标鉴定

1.0目标

制定程序就是为生物指标的鉴定提供指导。

2.0范围

此程序适用于生物指示剂的鉴定，即硬脂酸地芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）ATCC 7953和萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）（枯草芽孢杆菌）ATCC 9372，用于高压灭菌和隧道验证。

3.0责任

微生物学家

4.0问责制

质量检查和质量控制主管

5.0程序

5.1生物指示剂培养物鉴定试验

5.1.1显微镜检查–将一块生物指示剂或安瓿悬于  10 ml无菌生理盐水中。轻轻摇晃悬浮液并将一圈悬浮液转移到载玻片上。进行革兰氏染色，并在显微镜下观察载玻片。亚末端溶胀的细胞中具有椭圆形内生孢子的革兰氏阳性棒表明嗜热脂肪地芽孢杆菌的身份。萎缩芽孢杆菌为革兰氏阳性，呈椭圆形和中心内生孢子状，细胞未肿胀。

5.1.2增长特征

5.1.2.1将一块生物指示剂（一个安瓿瓶）悬浮在10 ml营养肉汤中，并在37ºC下孵育48小时。从试管中在每两个含大豆酪蛋白消化琼脂培养基的培养皿中划线一圈。在30ºC至35ºC的温度下培养一个Petridish，在55ºC至60ºC的温度下培养24小时。
5.1.2.2如果在55ºC至60ºC的温度下培养的板显示出微生物生长的迹象，而在30ºC至35ºC的温度下培养的板未显示出微生物生长的迹象，则表明嗜热性地芽孢杆菌的身份。
5.1.2.3如果在30ºC至35ºC的温度下培养的平板显示出微生物生长的迹象，而在55ºC至60ºC的温度下培养的平板没有任何微生物生长的迹象，则表明存在萎缩芽孢杆菌。

5.2生物指标中总活菌计数

5.2.1从原始的单个容器中随机选择四根生物指示剂的孢子条。
5.2.2将每个孢子条放入带有三个6 mm玻璃珠和5.0 ml 无菌纯净水的无菌，带螺帽的平底管中。
5.2.3涡旋4到7分钟，直到纸架浸入纸浆。
5.2.4加入5.0毫升无菌纯净水。再次涡旋。
5.2.5将1 ml悬浮液转移到装有9 ml无菌纯净水和涡旋的试管中。
5.2.6将稀释管在95ºC–100ºC的预热浴中放置15±1分钟，以用于嗜热地热芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌80ºC至85ºC。
5.2.7拆下试管，并在冰浴（0ºC–4ºC）中迅速冷却。
5.2.8将每个热冲击管涡旋至少十秒钟。现在，连续稀释这些试管以产生30到300个菌落。将每个稀释管涡旋至少十秒钟。
5.2.9为每个等分试样准备单独的一系列板。将1.0毫升每种选定的稀释液分别放入两个培养皿中。
5.2.10将约20毫升融化的大豆酪蛋白消化琼脂倒入培养皿，冷却至45º至50ºC。旋转以确保充分混合并使琼脂凝固。
5.2.11将嗜热嗜热地芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌30ºC–35ºC在55º–60ºC的平板上颠倒并孵育48至72小时。可将在55ºC至60ºC的温度下孵育的设备放置在塑料袋中，以防止平板过度干燥。
5.2.12孵育后计数CFU。
5.2.13平均计数，然后乘以稀释因子，以计算每个原始单位的人口。
5.2.14将所有信息记录在生物学指标的人口确定记录中。
5.2.15对于生物指示剂，密封的安瓿瓶，在无菌的250 ml锥形烧瓶中取4安瓿瓶，并通过摇晃烧瓶侧面打破安瓿瓶。加入足量的无菌纯净水以制成100毫升＆涡旋或剧烈声处理以获得均匀的悬浮液。转移10毫升至无菌螺旋盖管中。执行上述步骤。

5.3孢子存活时间和杀死时间测试

对于嗜热地热芽孢杆菌
5.3.1为了存活时间，将一个生物指示剂放在一个合适的容器中，如培养皿的盖子，并将其放置在事先合格的高压灭菌器中。不要关闭培养皿，以使生物指示剂完全暴露在蒸汽中。根据生物指示剂分析证书，在121°C（±0.5ºC）的温度下运行蒸汽灭菌循环，以缩短生存时间。立即从高压灭菌器中卸下生物指示剂，并无菌转移到无菌SCDM中，然后将生物指示剂在55°C至60°C下孵育7天。
5.3.2为了消灭时间，将一个生物指示剂放在合适的容器中，如培养皿的盖子，然后将其放在事先合格的高压灭菌器中。不要关闭培养皿，以使生物指示剂完全暴露在蒸汽中。根据生物指示剂分析证书，在121°C（±0.5ºC）的温度下运行蒸汽灭菌循环，以达到zui小杀灭时间。立即从高压灭菌器中卸下生物指示剂，并无菌转移到无菌SCDM中，然后将生物指示剂在55°C至60°C下孵育7天。
5.3.3还要应用阳性和阴性对照。
5.3.4存活时间测试和阳性对照中应该有明显的增长，而杀灭时间测试和阴性对照中没有明显的增长。
对于萎缩芽孢杆菌
5.3.5对于存活时间，将一个生物指示剂放在合适的容器中，如培养皿的盖子，然后将其置于事先合格的DHS中。请勿关闭培养皿，以使生物指示剂完全暴露于干热中。根据生物指标分析证书，在160°C（±1ºC）的温度下运行DHS循环，以缩短生存时间。立即从DHS中卸下生物指示剂，并无菌转移到无菌SCDM中，然后将生物指示剂在30°C至35°C下孵育7天。
5.3.6为了消灭时间，将一个生物指示剂放在适当的容器中，例如培养皿的盖子，然后将其放置在事先合格的DHS中。请勿关闭培养皿，以使生物指示剂完全暴露于干热中。根据生物指示剂分析证书，在160°C（±1ºC）的温度下运行DHS循环，以达到zui小灭活时间。立即从DHS中卸下生物指示剂，并无菌转移到无菌SCDM中，然后将生物指示剂在30°C至35°C下孵育7天。
5.3.7还要应用正面和负面的控制。
5.3.8存活时间测试和阳性对照中应该有明显的增长，而杀灭时间测试和阴性对照中没有明显的增长。

5.4注意事项

5.4.1请勿使用已融化并保存超过8小时的琼脂。
5.4.2为避免不准确的板数，使用2.0 ml移液器或孔径较大的移液器进行连续转移非常重要。这将有助于避免棉纤维堵塞移液器吸头。

5.5极限/验收标准

如果每个载体的活孢子的对数平均数不小于0.3 log，且不超过每个载体的对数标记的孢子数对总活菌数的0.48，则满足测试要求。
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6.0缩写

SOP：标准操作程序
QA：质量保证
QC：质量控制
NA：不适用
SCDA：大豆酪蛋白消化琼脂
IPA：异丙醇
CFU：菌落形成单位